Lo sviluppo del sistema nervoso centrale richiede complessi meccanismi cellulari e molecolari, alla base del differenziamento neuronale e della formazione e maturazione delle sinapsi. È in questo contesto che il recettore ionotropico del glutammato NMDA gioca un ruolo fondamentale. In particolare, il recettore NMDA regola la neurotrasmissione e la plasticità sinaptica a livello delle sinapsi glutammatergiche, coinvolte in processi cruciali come l’apprendimento e la memoria, e per svolgere questa sua attività deve essere correttamente localizzato nella membrana postsinaptica. Risulta quindi necessario comprendere nel dettaglio i meccanismi molecolari che regolano la ritenzione sinaptica dei recettori NMDA.  

È inoltre noto che l’attivazione dei recettori NMDA induce un signalling intracellulare diverso a seconda della localizzazione del recettore. Infatti, i recettori NMDA possono essere sinaptici, localizzati all’interno della densità postsinaptica delle spine dendritiche, oppure extrasinaptici, localizzati lungo il dendrite. La stimolazione dei recettori sinaptici promuove stimoli importanti per la sopravvivenza cellulare e processi accoppiati a plasticità nervosa e apprendimento. La stimolazione dei recettori extrasinaptici, invece, porta ad effetti tossici per il neurone. 

Il laboratorio di Farmacologia della Neurodegenerazione, coordinato da Monica Di Luca e Fabrizio Gardoni, in cui sto svolgendo il mio dottorato, si occupa da molti anni di identificare e caratterizzare proteine di interazione del recettore NMDA che, legandosi al recettore, regolano l’internalizzazione del recettore e/o la sua lateralizzazione verso le membrane extrasinaptiche. Inoltre, è di nostro interesse valutare quale sia il ruolo di alterazioni della ritenzione sinaptica e della stabilizzazione dei recettori NMDA sia in malattie neurodegenerative che in malattie del neurosviluppo, in quanto in queste malattie è stata identificata in molti casi un’aumentata localizzazione, e quindi attività, di recettori NMDA extrasinaptici. 

A questo proposito, studi effettuati da numerosi laboratori, hanno permesso di identificare numerose mutazioni puntiformi, ovvero a livello di singoli aminoacidi, del recettore NMDA associate a disturbi del neurosviluppo, quali autismo e epilessia. Queste mutazioni possono determinare alterazioni della conformazione del recettore, della sua espressione o localizzazione in sinapsi. La maggior parte delle mutazioni riguardano il gene GRIN2A che codifica per la subunità GluN2A del recettore NMDA, identificate soprattutto in pazienti che soffrono di epilessia. 

Nel complesso, questi studi ci indicano che i meccanismi che regolano la corretta localizzazione sinaptica dei recettori NMDA hanno una fondamentale importanza sia in fisiologia che in patologia. Le interazioni tra le subunità del recettore NMDA e diversi partner proteici, giocano un ruolo fondamentale in questi eventi.

Tra le proteine scaffolding che stabilizzano il recettore NMDA in membrane sinaptiche tramite diretta interazione con il recettore, il nostro laboratorio ha focalizzato i propri studi su Rabphilin3A (Rph3A). Rph3A è stata identificata inizialmente nel terminale presinaptico, dove regola il trafficking e l’esocitosi delle vescicole contenenti il neurotrasmettitore. Il nostro laboratorio ha scoperto che Rph3A svolge un ruolo molto importante anche nel compartimento postsinaptico, dove forma un complesso proteico con la subunità GluN2A del recettore e un’altra proteina scaffolding, PSD-95. Il ruolo del complesso molecolare è di stabilizzare il recettore in membrana, prevenendo la sua internalizzazione.

Il mio progetto di dottorato si pone l’obiettivo di caratterizzare gli effetti indotti dalle mutazioni missenso del gene RPH3A  trovate nei pazienti (che portano allo sviluppo di una proteina alterata), per poter proporre RPH3A come nuovo gene candidato per i disturbi del neurosviluppo. Infatti, attraverso studi di sequenziamento genico, sono state identificate sei mutazioni nel gene RPH3A, che determinano cambiamenti di singoli aminoacidi della proteina, in pazienti affetti da disordini del neurosviluppo, dall’epilessia (resistente ai trattamenti farmacologici attualmente disponibili) ai disturbi dello spettro autistico. 

Durante il primo anno di dottorato, utilizzando modelli cellulari in vitro, abbiamo dimostrato che le mutazioni di Rph3A portano ad alterazioni importanti della funzionalità del recettore NMDA e, più in generale, della sinapsi glutammatergica. Infatti, l’espressione delle forme mutate di Rph3A nel nostro modello di neuroni primari ippocampali porta ad una ridotta ritenzione sinaptica dei recettori NMDA che contengono la subunità GluN2A, causando una attivazione aberrante extrasinaptica di questi ultimi e alterazione funzionale della sinapsi. L’identificazione di ulteriori soggetti con varianti patogene in questo gene potrebbe fornire un quadro più accurato della variabilità clinica. Inoltre, una caratterizzazione completa degli effetti associati alle mutazioni nel gene di RPH3A potrebbe favorire lo sviluppo di un possibile trattamento farmacologico per questi pazienti.